навіны

Палімеразная ланцуговая рэакцыя (ПЦР)

AP.BIO:

IST‑1 (ЕС)

,

IST‑1.P (LO)

,

IST‑1.P.1 (EK)

Тэхніка, якая выкарыстоўваецца для ўзмацнення або стварэння шматлікіх копій пэўнай мэтавай вобласці ДНК.

 

Ключавыя моманты:

  • Палімеразная ланцуговая рэакцыя, або ПЦР, з'яўляецца тэхнікай, каб зрабіць мноства копій пэўнай вобласці ДНК in vitro (у прабірцы, а не ў арганізме).
  • ПЦР грунтуецца на тэрмастабільнай ДНК-палімеразе, Так палімераза, і патрабуе ДНК грунтоўкі распрацаваны спецыяльна для вобласці ДНК, якая цікавіць.
  • У ПЦР рэакцыя шматкроць цыклічна праходзіць праз серыю змяненняў тэмпературы, што дазваляе вырабляць шмат копій мэтавай вобласці.
  • ПЦР мае мноства навуковых і практычных ужыванняў. Ён звычайна выкарыстоўваецца ў кланаванні ДНК, медыцынскай дыягностыцы і судова-медыцынскім аналізе ДНК.

Што такое ПЦР?

Палімеразная ланцуговая рэакцыя (ПЦР) — гэта звычайная лабараторная тэхніка, якая выкарыстоўваецца для стварэння шматлікіх копій (мільёнаў ці мільярдаў!) пэўнай вобласці ДНК. Гэтая вобласць ДНК можа быць усё, што цікавіць эксперыментатара. Напрыклад, гэта можа быць ген, функцыю якога даследчык хоча зразумець, або генетычны маркер, які выкарыстоўваецца судмедэкспертамі для супастаўлення ДНК на месцы злачынства з падазраванымі.

Як правіла, мэта ПЦР - зрабіць дастатковую колькасць мэтавай вобласці ДНК, каб яе можна было прааналізаваць або выкарыстаць іншым спосабам. Напрыклад, можа быць адпраўлена ДНК, ампліфікаваная метадам ПЦР паслядоўнасць, візуалізаваны па гель-электрафарэз, або кланаваны у плазміду для далейшых эксперыментаў.

ПЦР выкарыстоўваецца ў многіх галінах біялогіі і медыцыны, уключаючы даследаванні малекулярнай біялогіі, медыцынскую дыягностыку і нават некаторыя галіны экалогіі.

Taq палімераза

Падабаецца Рэплікацыя ДНК у арганізме ПЦР патрабуе фермента ДНК-палімеразы, які стварае новыя ніткі ДНК, выкарыстоўваючы існуючыя ніткі ў якасці мадэляў. ДНК-палімераза, якая звычайна выкарыстоўваецца ў ПЦР, называецца Так палімераза, пасля тэрмаўстойлівай бактэрыі, з якой яна была вылучана (Tгермус водuaticus).

Т. aquaticus жыве ў гарачых крыніцах і гідратэрмальных крыніцах. Яго ДНК-палімераза вельмі тэрмаўстойлівая і найбольш актыўная каля 70 °\text C70°C70, °, пачатковы тэкст, C, канчатковы тэкст (тэмпература, пры якой чалавек або кішачная палачка ДНК-палімераза была б нефункцыянальнай). Гэтая тэрмаўстойлівасць робіць палімеразу Taq ідэальнай для ПЦР. Як мы ўбачым, высокая тэмпература выкарыстоўваецца неаднаразова ў ПЦР дэнатурацыя матрычную ДНК або аддзяліць яе ніткі.

ПЦР-праймеры

Як і іншыя ДНК-полимеразы, Так палімераза можа ствараць ДНК толькі ў тым выпадку, калі ёй даць а грунтоўка, кароткая паслядоўнасць нуклеатыдаў, якая забяспечвае адпраўную кропку для сінтэзу ДНК. У рэакцыі ПЦР эксперыментатар вызначае ўчастак ДНК, які будзе скапіяваны або ампліфікаваны праймерамі, якія яна ці ён выбірае.

ПЦР-праймеры ўяўляюць сабой кароткія кавалачкі однонитейчатой ​​ДНК, звычайна даўжынёй каля 202020 нуклеатыдаў. У кожнай рэакцыі ПЦР выкарыстоўваюцца два праймеры, і яны распрацаваны так, што флангуюць мэтавую вобласць (рэгіён, які варта скапіяваць). Гэта значыць, ім даюцца паслядоўнасці, якія прымусяць іх звязвацца з процілеглымі ніткамі матрычнай ДНК, толькі па краях вобласці, якую трэба скапіяваць. Праймеры звязваюцца з шаблонам шляхам камплементарнага спалучэння падстаў.

Шаблон ДНК:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Грунт 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Грунт 2:

Калі праймеры звязаны з шаблонам, яны могуць быць пашыраны з дапамогай палімеразы, і вобласць, якая знаходзіцца паміж імі, будзе скапіравана.

[Больш падрабязная схема, якая паказвае напрамак ДНК і праймераў]

Этапы ПЦР

Ключавымі інгрэдыентамі рэакцыі ПЦР з'яўляюцца Так палімераза, праймеры, матрычная ДНК і нуклеатыды (будаўнічыя блокі ДНК). Інгрэдыенты збіраюцца ў трубку разам з кофакторами, неабходнымі для фермента, і праходзяць праз паўторныя цыклы награвання і астуджэння, якія дазваляюць сінтэзаваць ДНК.

Асноўныя крокі:

  1. Дэнатурацыя (96 °\тэкст C96°C96, °, пачатковы тэкст, C, канчатковы тэкст): Моцна нагрэйце рэакцыю, каб аддзяліць або дэнатураваць ніткі ДНК. Гэта забяспечвае адналанцужны шаблон для наступнага кроку.
  2. Адпал (555555 - 656565°\тэкст C°C°, пачатковы тэкст, C, канчатковы тэкст): астудзіце рэакцыю, каб праймеры маглі звязвацца са сваімі камплементарнымі паслядоўнасцямі на одноцепочечной матрычнай ДНК.
  3. Пашырэнне (72 °\тэкст C72°C72, °, пачатковы тэкст, C, канчатковы тэкст): павысіць тэмпературу рэакцыі так Так палімераза пашырае праймеры, сінтэзуючы новыя ніткі ДНК.

Гэты цыкл паўтараецца 252525 - 353535 разоў у тыповай рэакцыі ПЦР, якая звычайна займае 222 - 444 гадзіны, у залежнасці ад даўжыні ўчастка ДНК, які капіюецца. Калі рэакцыя эфектыўная (працуе добра), мэтавая вобласць можа перайсці ад адной або некалькіх копій да мільярдаў.

Гэта таму, што ў якасці шаблону кожны раз выкарыстоўваецца не толькі арыгінальная ДНК. Замест гэтага новая ДНК, атрыманая за адзін раунд, можа служыць у якасці шаблону ў наступным раўндзе сінтэзу ДНК. Ёсць шмат копій праймераў і шмат малекул Так палімераза, якая плавае ў рэакцыі, таму колькасць малекул ДНК можа прыкладна падвойвацца ў кожным раундзе цыклу. Гэтая карціна экспанентнага росту паказана на малюнку ніжэй.

Выкарыстанне гель-электрафарэзу для візуалізацыі вынікаў ПЦР

Вынікі рэакцыі ПЦР звычайна візуалізуюць (робяцца бачнымі) з дапамогай гель-электрафарэзГель-электрафарэз гэта тэхніка, пры якой фрагменты ДНК працягваюцца праз гелевую матрыцу электрычным токам, і яна падзяляе фрагменты ДНК у залежнасці ад памеру. Звычайна ўключаецца стандартная або ДНК-левіца, каб можна было вызначыць памер фрагментаў у ПЦР-ўзоры.

Фрагменты ДНК аднолькавай даўжыні ўтвараюць на гелі «палоску», якую можна ўбачыць на вока, калі гель афарбоўваць ДНК-злучаючым фарбавальнікам. Напрыклад, рэакцыя ПЦР, якая вырабляе фрагмент 400400400 пар падстаў (bp), будзе выглядаць так на гелі:

Левая паласа: лесвіца ДНК з палосамі 100, 200, 300, 400, 500 п.н.

Правая паласа: вынік рэакцыі ПЦР, паласа пры 400 п.н.

Паласа ДНК змяшчае шмат-шмат копій мэтавай вобласці ДНК, а не толькі адну або некалькі копій. Паколькі ДНК мікраскапічная, павінна быць шмат яе копій, перш чым мы зможам убачыць яе на вока. Гэта вялікая частка таго, чаму ПЦР з'яўляецца важным інструментам: ён вырабляе дастатковую колькасць копій паслядоўнасці ДНК, каб мы маглі бачыць або маніпуляваць гэтым участкам ДНК.

Прымяненне ПЦР

Выкарыстоўваючы ПЦР, паслядоўнасць ДНК можа быць узмоцнена мільёны або мільярды разоў, вырабляючы дастатковую колькасць копій ДНК для аналізу з дапамогай іншых метадаў. Напрыклад, ДНК можна візуалізаваць з дапамогай гель-электрафарэзу, які адпраўляецца паслядоўнасць, або пераварваецца з дапамогай рестриктаз і кланаваны ў плазміду.

ПЦР выкарыстоўваецца ў многіх навукова-даследчых лабараторыях, а таксама мае практычнае прымяненне ў крыміналістыцы, генетычным тэставанні і дыягностыцы. Напрыклад, ПЦР выкарыстоўваецца для ўзмацнення генаў, звязаных з генетычнымі парушэннямі, з ДНК пацыентаў (або з ДНК плёну, у выпадку прэнатальнага тэставання). ПЦР таксама можа быць выкарыстаны для праверкі на наяўнасць бактэрыі або ДНК-віруса ў арганізме пацыента: калі ўзбуджальнік прысутнічае, магчыма ўзмацненне ўчасткаў яго ДНК з узору крыві або тканіны.

Прыклад праблемы: ПЦР у крыміналістыцы

Выкажам здагадку, што вы працуеце ў судова-медыцынскай лабараторыі. Вы толькі што атрымалі ўзор ДНК з валасоў, пакінутых на месцы злачынства, а таксама ўзоры ДНК трох магчымых падазраваных. Ваша задача складаецца ў тым, каб вывучыць пэўны генетычны маркер і паглядзець, ці адпавядае хто-небудзь з трох падазраваных ДНК валасоў для гэтага маркера.

Маркер пастаўляецца ў двух алелях, або версіях. Адзін утрымлівае адзін паўтор (карычневая вобласць унізе), а другі змяшчае дзве копіі паўтору. У рэакцыі ПЦР з праймерамі, якія флангуюць вобласць паўтору, першы алель вырабляе 200200200 \text{bp}bpstart text, b, p, канчатковы тэкставы фрагмент ДНК, у той час як другі вырабляе 300300300 \text{bp}bpstart тэкст, b , p, канчатковы тэкст фрагмент ДНК:

Алель маркера 1: праймеры, якія фланкуюць вобласць паўтору, узмацняюць фрагмент ДНК памерам 200 п.н.

Алель маркера 2: праймеры, якія фланкуюць вобласць паўтору, узмацняюць фрагмент ДНК памерам 300 п.н.

Вы праводзіце ПЦР на чатырох узорах ДНК і візуалізуеце вынікі з дапамогай гель-электрафарэзу, як паказана ніжэй:

У геля пяць палос:

Першая паласа: лесвіца ДНК з палосамі 100, 200, 300, 400 і 500 п.н.

Другая паласа: ДНК з месца злачынства, дыяпазон 200 bp.

Трэцяя паласа: ДНК падазраванага № 1, паласа 300 п.н.

Чацвёртая паласа: ДНК падазраванага № 2, палосы 200 і 300 п.н.

Пятая паласа: ДНК падазраванага №3, паласа 200 п.н.

ДНК якога падазраванага супадае з ДНК з месца злачынства на гэтым маркеры?

Выберыце 1 адказ:

Выберыце 1 адказ:

(Выбар А)

A

Падазраваны 111

(Выбар B)

B

Падазраваны 222

(Выбар C)

C

Падазраваны 333

(Выбар D)

D

Ніхто з падазраваных

[Падказка]

Мы не змаглі ацаніць ваш адказ. Выглядае на тое, што вы пакінулі штосьці пустым або ўвялі няправільны адказ.

Праверце

Больш падрабязна аб ПЦР і судова-медыцынскай экспертызе

У рэальных судова-медыцынскіх экспертызах ДНК з месца злачынства тэхнічныя спецыялісты праводзяць аналіз, канцэптуальна падобны да аналізу ў прыведзеным вышэй прыкладзе. Аднак шэраг розных маркераў (а не толькі адзіны маркер у прыкладзе) будзе параўноўвацца паміж ДНК месца злачынства і ДНК падазраваных.

Акрамя таго, маркеры, якія выкарыстоўваюцца ў тыповым крыміналістычным аналізе, бываюць не толькі ў двух розных формах. Замест гэтага яны вельмі высокія паліморфны (полі = шмат, морф = форма). Гэта значыць, яны бываюць у многіх алелях, якія адрозніваюцца невялікімі крокамі даўжыні.

Найбольш часта выкарыстоўваецца тып маркераў у крыміналістыцы, наз кароткія тандэмныя паўторы (STR), складаюцца з мноства паўтаральных копій адной і той жа кароткай нуклеатыднай паслядоўнасці (як правіла, даўжынёй ад 222 да 555 нуклеатыдаў). Адзін алель STR можа мець 202020 паўтораў, у той час як іншы можа мець 181818, а іншы проста 101010^11пачатковы надрадковы, 1, канчатковы надрадковы.

Даследуючы некалькі маркераў, кожны з якіх бывае ў розных алельных формах, судмедэксперты могуць стварыць унікальны генетычны «адбітак пальцаў» з узору ДНК. У тыповым аналізе STR з выкарыстаннем маркераў 131313 верагоднасць ілжывага спрацоўвання (два чалавекі з аднолькавым ДНК-адбіткам пальцаў) менш за 111 у 101010 \text{мільярд}мільярдных тэкстах, b, i, l, l, i, o, n, канец тэксту^11пачаць надрадковы, 1, канец надрадковы!

Хаця мы можам думаць пра доказы ДНК, якія выкарыстоўваюцца для асуджэння злачынцаў, яны адыгралі вырашальную ролю ў вызваленні ілжыва абвінавачаных (у тым ліку некаторых, якія сядзелі ў турме на доўгія гады). Судова-медыцынская экспертыза таксама выкарыстоўваецца для ўстанаўлення бацькоўства і ідэнтыфікацыі чалавечых парэшткаў з месцаў катастрофы.

[Атрыбуцыя і спасылкі]

Вы студэнт ці настаўнік?

СтудэнтНастаўнік

 


Час публікацыі: 08 студзеня 2021 г